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...制定国标深度解读系列(四) ——GB/T30990-2014《溶菌酶活性...


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为什么制定溶菌酶活性测定标准

溶菌酶(Lysozyme),又称胞壁质酶,在自然界中分布极为广泛,已经发现高等动植物组织及分泌物、原生动物、昆虫和微生物中都有溶菌酶的存在。其中卵清溶菌酶是发现最早、研究最多的溶菌酶,其等电点为pI 11.16,可适应pH 2-10的广泛pH变化范围。溶菌酶作用机制为降解细菌细胞壁中N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4 糖苷键,引起细菌裂解,尤其是革兰氏阳性菌。

溶菌酶在基础研究领域、医药保健和食品工业中都有着广泛的应用,不仅在生物技术科研中作为一种重要的工具酶,在食品工业中也是一种理想的保鲜和防腐添加剂。目前国内已针对口腔溃疡、喉咙肿痛推出了溶菌酶口腔含片,更推出了含溶菌酶牙膏等产品。

溶菌酶常以冻干粉的形式保存及运输,在食品或医药保健品中的使用则更是处于复杂多变的环境中。冷冻干燥的过程会对酶蛋白的天然构造造成一定的改变以至于影响其原有的酶活力,食品或者医药品加工过程对酶蛋白结构也会造成不可避免的影响,可能导致酶活力与加入前原有酶活力相比有所下降。其酶活力单位是否还与厂家说明中标识的酶活性强度一致,缺乏相关的标准进行规范约束和验证,这使得市场上溶菌酶的质量难以得到保证。因此迫切需要国家建立统一规范的酶活性检测标准。

为什么以溶壁微球菌为底物的分光光度法作为标准方法?

目前溶菌酶的检测主要有基于其酶活性的、基于构象的以及基于免疫学的方法。其中基于其酶活性的方法根据底物的不同分为基于壳聚糖的和基于溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)的,而基于溶壁微球菌的方法又包括了平板扩散法、琼脂糖火箭电泳法、比色法;基于其构象的方法包括HPLC、毛细管电泳、纳米金比色法、适配体生物传感器法、石英晶体微天平法;基于免疫学的方法包括ELISA法。其中,采用比色法以溶壁微球菌为底物检测溶菌酶活性的方法为食品添加剂专家联合委员会(JECFA,Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives)推荐检测方法。

之前的标准GB/T 25879-2010《鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定 分光光度法》存在缺点,需进行改进。例如:(1)方法中需要先用标准品进行梯度稀释于281nm处做标准酶浓度曲线,再通过对鸡蛋清稀释检测定量。由于281nm处各种蛋白质均可以有吸收峰,并非溶菌酶的特异性吸收峰。若以此波长进行定量后再进行计算其比活力会比实际值低。(2)采用溶壁微球菌作为底物,增菌时间为9-10h,此时溶壁微球菌所处的生长状态未见文献报道,由于溶菌酶作用于溶壁微球菌的细胞壁,而处于不同的生长时期其细胞壁的形成状态不同,因此应测量溶壁微球菌在特定培养条件下的细菌生长曲线。(3)检测时底物浓度为OD450nm 1.2-1.4,然而目前紫外可见分光光度计的检测精确度越来越高,对于OD450nm 1.300可以实现准确定量,并且对于OD450nm 1.2增加到OD450nm 1.4增加大量菌体才能达到,检测值亦有所区别。(4)检测时读取15s和75s的吸光度值,15s时反应体系处于剧烈变动时期,不适合作为读值点。

溶壁微球菌对溶菌酶极为敏感,该菌细胞壁上含有大量的肽聚糖聚合物,N乙酰胞壁酸和N乙酰葡糖胺之间由糖苷键链接形成多聚链并且与多肽相连,溶菌酶催化了这一链的断裂,导致细胞壁的脆裂。溶壁微球菌早期也被称为藤黄微球菌(Micrococcus luteus),是微球菌属(Micrococcus)的模式菌种。其在《伯杰氏细菌鉴定手册》(1984年版)中属于细菌目-革兰氏阳性球菌-微球菌属。为球菌,直径为1.0-2.0微米,细胞单生、对生和向几个方向分裂而形成四联体、不规则的堆团或规则的立方堆形,不运动。细胞壁的肽聚糖含有独特的L赖氨酸肽亚单位以及氨基葡萄糖、胞壁酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸,无磷壁质。生成四联或不规则细胞堆团的菌株形成光滑、凸起并具有整齐边缘的菌落。形成立方堆菌株的菌落表面常呈颗粒状和无光泽。菌落呈黄色、黄绿色或橙色,有些菌株形成一种能扩散到培养基内的紫色素。

溶菌酶作用于溶壁微球菌细胞时,首先将细胞壁裂解去除,这一步导致了原生质体状态细胞产生,至此溶菌酶活力作用停止,而更深一层次的细胞裂解则由缓冲溶液中的水成分的渗透作用导致的,并且通过核糖核酸的溶出导致溶液的粘稠程度加大。由此得出采用溶壁微球菌作为底物检测溶菌酶活性,主要利用的为溶壁微球菌细胞壁,而在细菌生长的不同状态下,因其细胞壁的状态不同,也会导致酶活检测结果不同。本标准在制定过程中,对溶菌酶检测底物溶壁微球菌的不同增菌时间、不同浓度进行测试,摸索出一套稳定的制备方法,保证测试结果稳定性。

标准适用范围

本标准适用于生化试剂、工业产品及原料中溶菌酶活性的测定。

标准关键注意事项

1.溶壁微球菌应购买指定标准菌株(Micrococcus lysodeikticus Fleming,CGMCC 1.634)。

2. 溶壁微球菌在使用前应按照标准要求的步骤进行活化培养,使其处于最佳生长状态。

3.溶壁微球菌培养时配制的培养基应调整pH值,并于4℃保存。

4.菌悬液制备时应严格控制其吸光度值在450nm处于1.300。

5.市售溶壁微球菌冻干菌粉,由于不同厂家制备菌粉时采用的摇菌时间、温度、培养基条件未知,其细菌生长状态未知,会导致检测结果不统一;并且冻干时真空低温均会对细胞壁有一定的损伤,可能会导致检测值显著低于活菌,使用该类产品虽然便捷,但是需要和标准方法新鲜制备菌悬液的测定结果进行对比,确保结果一致才可以使用。

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